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极速11选5硫酸铵和氯化钙对质粒DNA提取的影响

发布日期: 2020-12-16 21:39

  硫酸铵和氯化钙对质粒DNA提取的影响 李渊 1,2 天津工业大学应用化学系,天津300160,中国;2天津大学生物化工系,天津300072,中国) 摘要:随着基因治疗及基因疫苗的不断发展,质粒的需求量迅速增加。本文以pcDNA3 为目的产物,考察了在 其提取过程中硫酸铵和氯化钙的加入对pcDNA3 收率的影响和对杂质的去除效果。实验发现:硫酸铵和氯化钙 的加入都可以明显降低质粒提取液中蛋白质、RNA 杂质的含量;但是氯化钙在降低蛋白质和RNA 含量的同时也 降低了质粒DNA 的收率。硫酸铵是去除蛋白质、RNA 杂质的良好试剂,同时能够保持较高的质粒DNA 收率。当 质粒提取液中硫酸铵浓度加入到2.5 时,质粒的纯化因子可达到10.2,而收率在90%以上。 关键词:基因治疗;基因疫苗;质粒;纯化;硫酸铵;氯化钙 AmmoniumSulfate CalciumChloride PlasmidDNA Yuan Li, Yan Sun AppliedChemistry, Tianjin Polytechnic University,Tianjin 300160, China; Biochemistry,Tianjin University, Tianjin 300072 China)Abstract: Interest producinglarge quantities plasmidDNA has recently increased rapidevolution genetherapy DNAvaccines. effectcalcium chloride ammoniumsulfate were invested plasmidpurification process. mainlyremoved calciumchloride ammoniumsulfate. However, calciumchloride calciumchloride, ammonium sulfate betterprecipitant protein.When ammoniumsulfate 90%while purificationfactor 10.2.Key words: Gene therapy, DNA vaccine, Plasmid, Purification, Calcium chloride, Ammonium sulfate 近些年来,随着基因工程、基因治疗和基因疫苗的不断发展,质粒的需求量迅速增加[1]。从菌体中 得到质粒粗品的方法有煮沸法、碱裂解法、SDS 裂解法等,其中碱裂解法是提取质粒最常用的方法。为 了达到药用标准,要对质粒粗品进行进一步纯化,其中色谱分离是纯化质粒的最有效方法 [2]。为了降低 色谱操作的负荷,,提高色谱分离的效率,在色谱操作之前往往要先对质粒提取液进行初步的纯化,降低 杂质的含量。RNA 和蛋白质是质粒提取液中的两种主要的杂质。在常规的分子生物学实验中RNA 除,一般先用RNA 酶对其进行降解,然后再采用一些方法去除降解后得到的核酸片段和核苷酸;而蛋 白质的去除多采用酚和氯仿抽提的方法。但是,RNA 酶一般都来自动物体,而且价格较高,而酚和氯仿 都是有毒的试剂。为了安全,在药用质粒的生产过程中上述试剂都是禁止使用的。另外,在质粒的提取 过程中还经常用到其它的一些试剂,如聚乙二醇、硫酸铵、氯化钙等来降低 RNA 和蛋白质等杂质的含 收稿日期:2006-07-27 作者简介:李渊,博士,研究方向:生物化工,化学工艺,Tel: , Email: 量[3,]。由于本研究的后期工作拟采用疏水色谱对质粒进行纯化,因此为了方便,本文中只考察硫酸铵、 氯化钙两种试剂的对质粒提取液的除杂效果。 本文以pcDNA3 为目的产物,考察了在其提取过程中硫酸铵和氯化钙的加入对pcDNA3 收率的影响 和对杂质的去除效果。 实验器材与方法1.1 实验试剂及器材 琼脂糖,溴酚蓝,二甲苯菁, 溴化乙锭(EB),异丙醇,十二烷基磺酸钠(SDS),三羟甲基氨基甲 烷(Tris),硫酸铵,氯化钙,醋酸钾,氢氧化钠(北京鼎国生物工程公司),DNA Marker(大连宝生物 技术有限公司),质粒DNA提取试剂盒(Mini preps DNA purification 系(美国Promega 公司),RNA/DNA 含量测定仪(Gene Quant,瑞典Amersham Biosciences 公司),高效液相色谱仪(Agilent 1100,美国Agilent 公司),分析用色谱柱分析用色谱柱(TSK GEL G-DNA-PW,TSK GEL 司),低温离心机(BiofugeStratos ,德国Heraeus),水平板电泳仪(DYY-2C sys tem,北京六一仪器厂), 凝胶成像系统(自组装,法国Vilber Lourmat 公司)。 1.2 菌种与质粒 实验菌种为含有pcDNA3 质粒的i DH5α 菌株。pcDNA3 为高拷贝质粒,其片段大小为5.4 kb。 1.3 质粒菌的培养 原始E.coli DH5ɑ 菌株在甘油中保存于-80 ,用它发酵生产质粒需要经过培养皿活化和两级摇瓶扩 (1)菌体的活化:用接种环挑取一环化冻的菌悬液接入氨苄青霉素浓度为150g/mL 的LB固体培 养基表面,涂布均匀后,将培养皿放入37培养箱中,过夜培养。从培养皿中挑取单菌落,接种到30 mL, 氨苄青霉素浓度为150 g/mL 的LB 液体培养基中,在180 转/分钟、37水浴摇床培养至对数生长晚期 (OD600=0.6)。 (2)放大培养:在含500 mL,150 /mL氨苄青霉素的2YT培养液中接种25mL对数生长晚期的 菌液,在37下,180 转/分钟培养16 小时,收集菌体。 .1.4 质粒纯品的制备 采用从 Promega 公司购买的质粒提取试剂盒制备质粒纯品,提取方法按照试剂盒提供的操作步骤进 1.5质粒粗品的制备 本实验采用碱裂解法进行质粒的初步提取 (1)当细菌的培养结束后,收集菌体。用SorvallGS3 转头(或者与其相当的转头)于4以4000 转/分钟离心15 分钟,弃掉上清,敞开离心管口并倒置离心管,使上清全部流尽。 (2)将上述沉淀重悬于100 mL的STE缓冲液中,按照步骤(1)离心,弃上清。 (3)将上述沉淀重悬于10 mL碱裂解液中,为了使菌体在以后的步骤中裂解充分,一定要使菌体 充分分散于溶液中,可用漩涡振荡器对其进行震荡。 (4)加入20 mL新配制的碱裂解液,盖紧瓶盖,立即缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀,以免 局部的pH值过高,使质粒发生不可逆的变性。不可剧烈振荡,以免细胞内的染色体DNA链发生断裂, 造成质粒的后续纯化过程复杂化,于室温下放置5 到10 分钟,放置的时间也不能过长,否则会发生质粒 DNA不可逆变性。 (5)加入10 mL用冰预冷的碱裂解液,封住管口,轻轻摇动离心管数次以混匀内容物,不可剧烈 振荡。在冰上放置10 分钟,可看到有白色絮状沉淀生成。这种白色的沉淀是由染色体DNA、高分子量的 RNA、钾离子/SDS/蛋白质/细胞壁复合物一起形成的。 (6)用Sorvall SS34 转头(或者与其相当的转头)于4以10000 转/分钟离心15 分钟,不开刹车而 使转头自然停止。 层干砂布把上清过滤至离心管中。在转移液体时,要小心,以免沉淀再次浮起,如果一旦沉淀再次浮起,可按上述离心方法再进行一次离心。 (8)向上述得到的质粒提取液中加入0.6 体积的异丙醇,混匀后在室温下静置15 分钟后,于室温以 10000 转/分钟离心15 分钟,弃上清。在进行这步操作时,要采取一定的措施,使离心机的温度由4 到室温,否则在低温下离心,溶液里的盐有可能也被沉淀下来。将离心管倒置于纸巾上除去残余的上清,在室温下用70%的乙醇刷洗管壁和管底,倒掉乙醇溶液后,用滴管将吸附于管壁的液滴吸尽。再次将离心 管倒置于纸巾上,使剩余的乙醇挥发掉。当乙醇挥发净后,加入1 mL的TE 缓冲液溶解沉淀。 1.6 用硫酸铵沉淀质粒提取液中的蛋白质和RNA 将2.5 得到的质粒提取液分成5个样品,分别加入不同量的硫酸铵固体,轻轻颠倒数次,使固体 硫酸铵充分溶解,4 静置15 分钟后于10000 转/分钟离心15 分钟。取上清,弃沉淀。用高效液相色谱 法测定提取液的质粒纯度和浓度,计算纯化因子(纯化因子=纯化后质粒的纯度/纯化前质粒的纯度),从 而考察硫酸铵对质粒提取的影响,确定硫酸铵的最佳加入量。 1.7 用氯化钙沉淀质粒裂解液中的蛋白质和RNA 在2.5(5)步中当加入溶液后,轻轻的摇动离心管,使液体混匀,然后加入一定体积5 M的氯化 钙溶液,摇匀,其它步骤同2.5 进行,用高效液相色谱法测定提取液中质粒纯度和浓度,计算纯化因子, 从而考察氯化钙的加入对质粒提取的影响。 1.8 分析方法 1.8.1 核酸的定量分析 质粒纯品由Promega质粒提取试剂盒制备,其浓度和纯度由Genequant DNA/RNA 核酸测定仪测定(以 溶解质粒的缓冲液为参比液)。将质粒纯品按一定的倍数进行稀释,以TSK GEL G-DNA-PW TSKGEL G-6000-PW XL 串连组成色谱柱组,以Tris-HCl (Tris 浓度为10 mM, pH=8,NaCl 浓度为0.3 M,EDTA mM)缓冲液为流动相,流速为0.4 mL/min,利用安捷伦高效液相色谱系统(紫外检测器,260 nm), 测定质粒的浓度和紫外吸收峰峰面积之间的关系,拟合标准曲线。结合标准曲线,利用高效液相色谱测 定样品中质粒的浓度和纯度,通过0.7%的琼脂糖凝胶电泳分析样品中不同形态质粒的含量。 1.8.2 质粒产品中蛋白质含量的测定 采用Bradford 法对样品中总蛋白质的含量进行测定。 首先绘制考马斯亮蓝的标准曲线,具体步骤为:分别向比色皿1和试管中加入3 mL考马斯亮蓝G-250 溶液,比色皿作为参比,用100微升注射枪吸取50 微升的BSA溶液加入试管中,摇匀后加入比色皿2 在595nm下测定其吸光度,两分钟后纪录吸光值,将蛋白质溶液按一定的比例进行稀释,按上述相同的 方法测定样品在595 nm下吸光度,以BSA浓度对吸光度OD595 作图,可得到考马斯亮蓝的标准曲线。 样品中总蛋白的测定:分别向比色皿1 和试管中加入3 mL考马斯亮蓝G-250 溶液,比色皿作为参比, 用100 微升注射枪吸取50 微升的待测溶液加入试管中,摇匀后加入比色皿2 中,在595 nm下测定其吸 光度,两分钟后纪录吸光值,由标准曲线的吸收值计算出样品中的蛋白质浓度。 实验结果与讨论2.1 质粒浓度和纯度的测定 为了验证菌体培养及Promega 试剂盒对质粒提取的成败,对试剂盒提取的质粒用限制性内切酶 (Bam 进行酶切,将酶切得到的质粒DNA和由试剂盒提取的质粒DNA同时进行琼脂糖凝胶电泳实验,其结果为图1。从此图可以看出:试剂盒提取的质粒经过酶切后变成了单一形态的线型质粒,而且其大小与 标准分子量中的5.4 kb 相对应,说明了通过试剂盒提取得到的核酸就是目的质粒pcDNA3。 用Genequant DNA/RNA 核酸测定仪测定质粒的浓度和纯度,结果表明其纯度为100%,其浓度为0.2 mg/mL,按比例稀释,用安捷伦高效液相色谱系统测定质粒浓度和紫外吸收峰峰面积之间的关系,利用 线性最小二乘法进行回归,得到标准曲线 其中X为紫外吸收峰峰的峰面积,Y为质粒的 浓度。 2.2 硫酸铵对质粒提取的影响 反映了硫酸铵的加入量对质粒提取液中质粒和蛋白质含量的影响。从此图可以看出:硫酸铵的加入对质粒收率的影响很小,但是却可以明显降低提取液中蛋白质的含量。当质粒提取液中硫酸铵的浓 度达到2.5 M时,质粒的收率仍在90% 以上;但是蛋白质的浓度由不加硫酸铵时的1.44 mg/mL降低到 0.13 mg/mL,由此可以看出:硫酸铵的加入可以明显的降低质粒提取液中蛋白质含量,从而保持较高的 质粒收率。 是质粒提取液经过硫酸铵处理前后的电泳图。从此图可以明显看出:硫酸铵的加入也可以明显的降低提取液中RNA的含量。图4 上、下两图分别是质粒提取液在硫酸铵处理前后的高效液相色谱图(其 中停留时间为30-40 min的成分为质粒DAN,停留时间为50-60min的RNA 和蛋白质,停留时间约为61min 的为小分子化合物,如EDTA等),此图更直观地反映出硫酸铵的加入可以除去大部分RNA和蛋白质等 杂质。结合此图可以计算得到在硫酸铵处理过程中质粒纯化因子为 10.2。由以上实验可以看出:硫酸铵 是对质粒提取液进行初步进化的良好试剂。它能有效的去除 RNA 和蛋白质等杂质,同时较高的质粒收 纯质粒在限制性内切酶酶切前后的电泳图Fig. pureplasmid before Lane1,marker, Lane pureplasmid, Lane Plasmiddigested 硫酸铵对质粒提取液中质粒和蛋白质浓度的影响Fig. ammoniumsulfate concentration 硫酸铵的加入对RNA的影响 Fig. PlasmidDNA Lane DNAmarker, Lane Pureplasmid; Lane Plasmidlysate after precipitation ammoniumsulfate, Lane Plasmidlysate before precipitation ammoniumsulfate 硫酸铵加入前后质粒提取液的色谱图Fig. Chromatographicprofile plasmidlysate before ammoniumsulfate 2.3 氯化钙对质粒提取的影响 低质粒提取液中蛋白质含量,但是在此过程中质粒的收率较低,当向质粒提取液中加入0.5体积 M的氯化钙溶液时,蛋白质浓度由不加氯化钙的1.44mg/mL降低到0.16 mg/ mL,而提取液中质粒浓 度由不加氯化钙时的0.89 mg/mL, 降低到0.42 mg/ Ml。由此可见,向裂解液中加入氯化钙可以明显降低提 取液中蛋白质的含量,但是氯化钙的加入也同时降低了提取液中目标产品质粒的浓度。图 上下两图分别是在质粒的提取过程中未加氯化钙 (0.5 体积,极速11选5,浓度为5 和加入氯化钙处理时得到的质粒提取液在高效液相色谱仪上的色谱图。通过此图,可以计算得到在氯化钙对质粒提取液的处理过程中的质粒的纯化因 子为6.5。 在质粒pcDNA3 的提取过程中考察了硫酸铵和氯化钙对质粒提取效果的影响,发现硫酸铵和氯化钙 的加入都可以明显降低质粒提取液中蛋白质、RNA 杂质的含量;但是氯化钙在降低蛋白质和 RNA 含量的同时也降低了质粒DNA 的收率。硫酸铵是去除蛋白质、RNA 杂质的良好试剂,同时能够保 持较高的质粒DNA收率。当质粒提取液中硫酸铵浓度加入到2.5 M时,质粒的纯化因子可达到10.2, 而收率在90% 以上。而且,通过此方案得到的初步纯化的提取液可以直接或经过适当的稀释,利用 疏水色谱进行纯化。 参考文献 etal, Direct gene transfer humancancer, Ann. NY Acad Sci., 1995, 772: 227~231 High-SpeedChromatographic Purification PlasmidDNA CustomizedBiporous Hydrophobic Adsorbent Biochemical Engineering Journal, ,2005,27: 33–39 plasmidDNA Escherichiacoli nucleic acids hydrophobicinteraction chromatography, Bioseparation, 2001, 10: 211–220 RNAImpurities HighSalt PlasmidDNA Purification Process: Use ExperimentalDesign DetermineReaction Conditions, Biotechnol. Bioeng., 2003, 83(5): 543–553 rapidalkaline extraction procedure screeningrecombinant plasmid DNA, Nucleic Acids Res., 1979,