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极速11选5核酸提取经验总结

发布日期: 2020-07-10 03:47

  核苷酸单体聚合而成的生物大分子,是生物细胞最基本和最重要的成分。一般认为,生物进化即始于核酸,因为在所有生命物质中只有核酸能够自我复制。今天已知核酸是生物遗传信息的贮藏所和传递者。一种生物的蓝图就编码在其核酸分子中。核酸是1869年米歇尔(F.Miescher)在脓液的白细胞中发现的。他当时称之为核素。阿尔特曼(R.Altmann)于1889年认识其酸性后,定名为核酸。

  核酸分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。这两类核酸有某些共同的结构特点,但生物功能不同。

  DNA贮存遗传信息,在细胞分裂过程中复制,使每个子细胞接受与母细胞结构和信息含量相同的DNA;RNA主要在蛋白质合成中起作用,负责将DNA的遗传信息转变成特定蛋白质的氨基酸序列。

  核酸的基本结构单元是核苷酸,核苷酸含有含氮碱基、戊糖和磷酸3种组分。碱基与戊糖构成核苷,核苷的磷酸酯为核苷酸。DNA和RNA中的戊糖不同,RNA中的戊糖是D-核糖;DNA不含核糖而含D-2-脱氧核糖(核糖中2位碳原子上的羟基为氢所取代)。核酸就是根据其中戊糖种类来分类的,DNA和RNA的碱基也有所不同。

  RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶,DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外,核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于水,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂,它们的钠盐比游离核酸易溶于水,RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L,DNA钠盐在水中为10g/L,呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中,DNA、RNA易水解,在中性或弱碱性溶液中较稳定。天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。**要从细胞中提取DNA时,先把DNP抽提出来,再把P除去,再除去细胞中的糖,RNA 及无机离子等,从中分离DNA。

  经典的裂解液几乎都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用,除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris),还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 等。去污剂则是通过使蛋白质变性,破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质,从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶,利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段,促进核酸与蛋白质的分开,同时,也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 (如GIT、GuHCl 等) 裂解的,该方法已经成为了 RNA 抽提的主流,却不是基因组 DNA 抽提的主流。

  (二)细胞的裂解方法 细菌细胞破碎方法有以下几种: 1)机械方法:超声波处理法、研磨法、匀浆法。关于超声波处理法,要设定好超声时间和间隙时间,一般超声时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间。 2)化学试剂法:用含SDS或CTAB的溶液处理细胞,在一定的pH环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相,pH环境则由加入的强碱(NaOH)或缓冲液( TE、STE等)提供,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀,缓冲液中的一些金属离子螯合剂( EDTA等)可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。 3)反复冻融法:将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。个人经验一般情况,37℃,3min,液氮3min,反复三次即可以。 4)酶解法:加入溶菌酶或蜗牛酶、蛋白酶K等,都可使细胞****壁破碎,核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1 ,4) 键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65 ℃及有EDTA、尿素(1~4mol/ L) 和去污剂(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。在实际工作中,酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。具体选择哪种或哪几种方法可根据细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。

  含蛋白酶的裂解方法,可以认为是抽提基因组 DNA 的首选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组 DNA 相连接的蛋白质的游离。蛋白酶的作用是使蛋白质变小,故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用;同时,巨大的基因组DNA 是很容易“缠”住大分子的东西的,蛋白质被蛋白酶消化变小后,则不容易被基因组 DNA “缠”住,有利于蛋白质在纯化操作中的去除,使最终获得的基因组 DNA 的纯度更高。另外一个思路是,如果基因组 DNA 与蛋白质 “缠”在一起,在纯化的过程中有两种可能:如果基因组 DNA 的特性占优势,则纯化时以 DNA 的形式被保留下来,导致蛋白质的残留;如果蛋白质的特性占优势,则纯化时以蛋白质的形式被去除,导致 DNA 的损失。当然去污剂裂解方法,仍然在细胞基因组 DNA 抽提方面有优势,尤其是当得率和纯度要求不是最高,而经济性及操作简单很重要时。控制好裂解液****/****样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀,可以实现最简单的操作,但纯度及得率的稳定性可能会比用PC抽提的差一些。

  高浓度蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法,是抽提 RNA 的首选。总 RNA 的抽提,最重要的是快速裂解细胞膜,至于与基因组 DNA 相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质 “缠”住的问题,因为都不会对以后的纯化产生大的影响,可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜,进而迅速抑制住细胞内的 RNA 酶,从而确保了 RNA 的完整性。除了极少量不适用该方法的样品 – 主要是植物,其它绝大部分样品的 RNA 的抽提,都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。当然有些样品,如肌肉,即使是 RNA 抽提,也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某个时候使用蛋白酶消化蛋白质) ,原因在于这些样品中的蛋白质,是非常难以去除的。该方法是获得最大得率和最高纯度的基础。

  含 CTAB 的裂解液,几乎成为富含多糖的样品,如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方法。该方法成功与否与两个因素有关:一是CTAB 的质量,二是洗涤的彻底程度。CTAB 的质量对裂解效率有很大的影响,而且,似乎还说不清楚原因,因为即使是同一公司生产的纯度一样的 CTAB,批号不同,效果就可能差别很大。洗涤去除CTAB 要比其它的盐难一些,同时,CTAB 的少量残留也会对酶活性有巨大影响,所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。裂解时的温度,多使用 65C;但如果发现降解严重或者得率太低,可以试一下 37C – 45C 这个相对低温的区域。

  SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法,具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的特点。控制好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方法成功的关键。蛋白质的沉淀效率在4C会更好一些,所以,加入溶液 III 后在 4℃静置一段时间以及采用 4℃离心去蛋白质,都可以提高质量。该方法不一定要使用 PC 纯化,但结合 PC 纯化,可以获得纯度很高的质粒。RNA 的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A (100ug/ml) 或者在最后的溶解液中加入 RNase A (25 ug/ml) 来实现。总的感觉是,在溶液 I 中使用 RNase A,RNA 的残留少一些。不过,经典沉淀几乎没有办法彻底去除RNA 残留。另外,对大质粒 (50 kb 以上),该方法可能会有问题。

  PCR 模板的简易裂解方法,也是使用面很广的一类方法。该方法的特点是无须纯化,样品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR,非常快速。也正因为不纯化,所以,假阴性 (即没有扩增出来的阳性) 比例也比较高。该方法最简单的就是反复冻融法,简便快捷,不需任何化学试剂,冻融离心,PCR检测就可以了。如果使用裂解法,哪么最简单的裂解液就是水,复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的 PCR 反应,而且能提高裂解效率,甚至还可能部分消除样品内抑制 PCR 反应杂质的东西,如 Triton X-100、甲酰胺等。再复杂一点的就会含有诸如 Chelex 100 之类的能吸附部分杂质的介质。操作也非常简单,多使用温度的变化来实现样品的裂解,如煮沸、或者高温-低温的多次循环等。该方法最适合从一大堆样品中找出阳性样品,但却不适合用于判断某一个样品是阳性还是阴性。降低样品使用量可以提高阳性率,因为样品量的降低,同时意味着 PCR 的抑制物量的降低。

  裂解液的用量原则是:确保能彻底裂解样品,同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低,将导致沉淀效率低,影响得率;浓度过高,去除杂质的过程复杂且不彻底,导致纯度下降。另外,裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的,而不是以核酸含量为基准,这一点务必牢记。

  就个人所知,目前在科研领域广泛使用的核酸纯化技术主要可以分为两大类:使用介质的和不使用介质的,使用介质的,一次就将核酸与其它所有杂质分开;不使用介质的,一定是首先将核酸和盐与大分子杂质分开,再通过沉淀核酸使核酸与盐分开 (PEG 沉淀和 LiCl 沉淀除外)。

  1)经典的使用苯酚/氯仿抽提的纯化技术:细胞裂解后离心分离含核酸的水相,加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25 ∶24 ∶1 体积) 混合液。依据应用目的,两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸) 或简单颠倒混匀(适用于分离高分子量核酸) 后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相,核酸则被留于上层水相。酚是一种有机溶剂,预先要用STE 缓冲液饱和,因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联;故在制备酚饱和液时要加入一特殊物质,以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪,使更多蛋白质变性,从而提高提取效率。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。核酸盐可被一些有机溶剂沉淀,通过沉淀可浓缩核酸,改变核酸溶解缓冲液的种类以及去除某些杂质分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀,在含核酸的水相中加入p H5. 0~5.5 ,终浓度为0.3M的NaAc 或KAc 后,钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷,在酸性环境中促进核酸的疏水复性。然后加入2~2. 5 倍体积的乙醇,经一定时间的孵育,可使核酸有效地沉淀。其他的一些有机溶剂(异丙醇、聚乙二醇( PEG) 等)和盐类(10. 0mol/ L 醋酸铵、8. 0mol/ L 的氯化锂、氯化镁和低浓度的氯化锌等) 也用于核酸的沉淀。

  2)使用离子交换介质的纯化技术:将裂解液过柱,核酸被联结在离子交换介质上;洗涤去除残留的杂质后,用高盐缓冲液将核酸从介质上洗脱下来。再经过标准的乙醇/异丙醇沉淀、乙醇洗涤、干燥等操作,获得纯的核酸,溶解于合适的缓冲液中。 3)使用吸附介质的纯化技术:将裂解液过柱,核酸被吸附介质选择性吸附;洗涤去除残留的杂质后,用水或者合适的低盐缓冲液将核酸从介质上洗脱下来,就可以直接用于后续实验。 4) 密度梯度离心法:密度梯度离心也用于核酸的分离和分析。双链DNA、单链DNA、RNA 和蛋白质具有不同的密度,因而可经密度梯度离心形式形成不同密度的纯样品区带,该法适用于大量核酸样本的制备,其中氯化铯2溴化乙锭梯度平衡离心法被认为是纯化大量质粒DNA 的首选方法。氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质,梯度液中的溴化乙锭与核酸结合,离心后形成的核酸区带经紫外灯照射,产生荧光而被检测,用注射针头穿刺回收后,通过透析或乙醇沉淀除去氯化铯而获得纯化的核酸。

  PC(P是英文酚的缩写,C是英文氯仿的缩写)抽提/醇沉淀方法,是一个永不过时的方法。稳定、可靠、经济、方便。PC抽提可以彻底去除蛋白质,醇沉淀可以去除盐,对于一般的干净的样品 (杂质为蛋白质),该方法完全可以获得高质量的核酸。虽然每次 PC 抽提都会损失一部分核酸 (因为不可能将水相全部移取),以及低浓度核酸的醇沉淀效率低,但这些问题都可以靠操作的调整而得以解决或者减少影响。该方法的最大的问题是不适合大规模抽提。PC抽提是去除蛋白质的一个非常有效的手段。苯酚能使蛋白质变性,变性后的蛋白质从水相中被析出,处于苯酚中或者苯酚/水相之间。PC 抽提的关键是,一要混匀彻底,二要用量足够。彻底混匀,才能确保苯酚与蛋白质的充分接触,使蛋白质完全变性。许多人总是担心混匀的剧烈程度是否会对核酸,尤其是基因组 DNA 造成破坏,实际上大可不必如此小心。剧烈的混匀操作,是会部分打断大分子的基因组 DNA,但该破坏作用不会强烈到 DNA 变成 10kb 以内的小片段。手剧烈晃动混匀后,基因组 DNA 的片段,大部分会大于 20kb,这个大小,除了一些特别的要求外,对 PCR 和酶切,都是完全适用的。如果要求的片段非常大,如构建文库用,则不能使用剧烈的混匀方法,而只能来回温和颠倒混匀 – 此时的关键是:裂解液的比例要足够大,使体系不要太粘稠。用量要足够,是因为苯酚去除蛋白质是有一定的饱和度的。超过了该饱和度,裂解体系中的蛋白质不会被一次去除,必须靠多次抽提,方可彻底去除。另外,体系太粘稠的坏处是,蛋白质难以彻底去除,以及基因组 DNA 会断裂得更厉害,所以要注意裂解液与样品的比例。4C离心操作有利于更彻底去除蛋白质。PC 抽提的另外一个用途是,利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特点,在 RNA 抽提时获得 DNA 残留极少的 RNA。不过有一点要提醒的是,有些植物样品,在去除某些杂质之前,是不能使用 PC 抽提的,否则核酸必定降解。

  高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法,同样也是一个非常不错的方法。与 PC 抽提方法相比,除了纯度的稳定性可能要低一点外,该方法几乎克服了 PC 抽提的所有缺点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是,可以用于大规模抽提,不足是纯度 (蛋白质残留) 不够稳定。蛋白质的沉淀效率在 4C 会更好一些。

  介质纯化方法,是一个越来越受到重视的方法。其最大特点是非常适合大规模核酸抽提,并且因为受人为操作因素影响小,纯度的稳定性很高 (虽然纯度不一定比PC 纯化方法更高)。其致命弱点是样品过量。介质可以分为两大类,一类是柱式的,即介质被预先装填在下面是通的柱子里;另外一类则是颗粒状 (如Glassmilk、磁性小珠等)。颗粒状的介质的纯化操作与经典的醇沉淀差别不大,都是通过数次的加液-倒液过程,干燥后,溶解即可获得纯化好的核酸。柱式纯化的操作虽然也是有加液-倒液过程,但因为加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中,与含有核酸的柱子完全是分开的,所以洗涤更彻底,操作更省力 (不用操心将核酸倒掉了,或者液体的残留)。不过,介质纯化方法的成本是最高的。

  1)沉淀的原理目的:目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来,从而实现核酸与其它杂质–主要是盐的分离。就核酸而言,标准的醇沉淀要求有一定的盐及某一比例的醇用量,但这决不是说这些盐是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。实际操作中不难发现,当裂解体系中核酸的浓度达到一定水平后,即使体系中不含教科书中建议的盐,单独使用醇也可以使核酸沉淀下来;或者含有盐,使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下来 (当然,得率可能会降低)。知道这一点的意义在于:不要迷信标准方法的唯一性;相反,当使用标准方法碰到问题 – 主要是纯度问题时,完全可以通过调整沉淀条件来改善。最有参考价值的是的一个沉淀方案:一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇,可以大大降低多糖残留。另外一个问题就是,要坚信核酸的醇沉淀过程同样也是其它杂质的沉淀过程;调整醇沉淀的条件,虽然会降低核酸的得率,但因为可以大大提高纯度。

  沉淀剂的选择:醇沉淀使用异丙醇还是乙醇,我们并没有发现这二者对质量有大的影响。异丙醇沉淀的核酸比较紧凑,帖壁紧,颜色不是很白;乙醇沉淀的核酸比较蓬松,容易从壁上移动,颜色比较白。这是现象,少量核酸用异丙醇沉淀,大量核酸用乙醇沉淀。至于异丙醇沉淀更容易沉淀下盐的说法,我们没有碰到过,我更觉得出现该现象的原因就在洗涤的不彻底。当然,也不要忘记异丙醇沉淀的最大优点是体积小,可以使绝大部分的小量抽提操作在 1.5ml 离心管内完成。但由于其沉淀物很紧凑,洗涤时其中心部分不容易被洗涤到,所以,洗涤异丙醇沉淀的核酸的关键是:一定要使沉淀悬浮起来,一定要放置一段时间使沉淀最终变成蓬松的白色。如果再洗涤一次,质量决不会有问题的。当然,沉淀所用的试剂,不仅仅就乙醇和异丙醇,还有包括PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀,虽然它们远没有醇沉淀的高使用频率,但却各有特点。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA,CTAB 可以从含多糖的裂解体系中将核酸沉淀下来。PEG 是沉淀病毒颗粒的方便手段。 3) 沉淀温度的选择:如果核酸抽提的起始样品是杂质比较多时,原则上不要使用低温沉淀。低温沉淀能提高沉淀效率:当核酸浓度很低时,效果明显;当核酸浓度比较高时,效果不明显,但却会导致杂质的大大增加。

  1)洗涤原理与目的:洗涤对于整个提取过程来说,也是非常重要的。洗涤,首先一定要将沉淀悬浮起来;第二就是要控制一定的时间,尤其是当核酸沉淀比较大时 (使核酸沉淀最终蓬松);第三是少量多次;第四则是去上清要彻底。大部分资料中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水纸上片刻”,这一说法,对于质量好的离心管,如果离心管是经过硅化的,因为液体几乎不挂壁,所以上清可以去除得非常彻底;好的管子,即使没有经过硅化,残留量也非常少,也没有什么问题;差的管子,液体的挂壁非常可观,其残留量多到会影响后续的实验。避免液体残余的一个好方法,就是倒掉液体后再短暂离心,将残液用移液器吸出。还有需大家牢记的是,残液中都含有上一步操作中的杂质,其残留量与混匀程度、核酸沉淀的大小都有关。挥发时去掉的是乙醇,杂质是不会被挥发去除的。这步,切忌不要用手甩,这样容易将核酸甩掉。另外,核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也决定了洗涤的强度。沉淀越大,裂解液的裂解能力越强,洗涤越要彻底:放置时间相对要长一点,洗涤次数也要考虑增加。当然,乙醇浓度的选择也非常重要,一般情况,洗涤一定要用室温的 75% 乙醇。

  1)核酸溶解:纯化后的核酸,其中 RNA 以水溶解为主,DNA 则多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。经典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解,其中原因是有人认为 EDTA 可以减少 DNA 被可能残留下来的DNase 降解的风险;如果操作过程控制得当,DNase 的残留几乎是可以忽略的,完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。

  2)核酸保存:基本上,核酸在保存中的稳定性,与温度成反比,与浓度成正比。一般的我们选择,-20℃或70℃保存的稳定。如果温度不合适,保存中核酸发生降解或者消失,首要原因是酶残留导致的酶解,第二个原因则是保存核酸溶液的 pH 值不合适导致的水解(RNA 在弱酸性更稳定,而 DNA 在弱碱性更合适)。还有一个不为人重视的,就是EP ****管对核酸的影响。首先一定要坚信一点,那就是核酸一定会与装它的容器的接触面发生反应,达到某种均衡。EP ****管的材质,首先可能吸附核酸,其次还可以诱导核酸的结构发生某些变化,如变性。在核酸的浓度比较高时,这个现象可能观察不到;当核酸浓度很低时,则比较明显了。在低浓度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以稳定核酸,虽然已经为实验所证明,但许多实验人员并没有将该建议当回事。现在制造 EP 管的材料远多于过去。这些新出现的材料,在强度、透明度等物理特征方面可能比原来的纯 PP 材质要好许多,但其化学特征,尤其是对核酸稳定性的可能影响,远没有研究透彻。正如现在的质粒可以改造得越来越适用某些要求一样,其负面产物可能是,抽提的质粒电泳的构型越来越多:除了原来的三种带型外,还可能出现 denatured cc 、multimeric forms of cc 等等带型。

  应用最广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。在中等浓度单价阳离子存在下,加入一定量的乙醇后,所形成有核酸沉淀可经离心而回收,甚至对低至pg量的DNA或RNA,也可定量回收。回收的核酸可按所需浓度,再溶于适当的缓冲液中。 核酸浓缩的具体操作时,可向含样品的小离心管中加入V/10单价阳离子盐贮存液2V无水乙醇,混匀,放冰水浴中15~30min,取出目测平衡,0~4度,12000g,离心10min。吸弃上清,再另70%乙醇0.5~1ml,12000g,0~4度洗涤离心2min。吸弃上清,沉淀用油泵抽干或打开盖子晾干后,溶于适当体积的缓冲液中。单价阳离子盐的选择,极速11选5。主要基于下述考虑:用醋酸铵可减少dNTP的共沉淀,但在以后要作核酸的磷酸化时应避免用醋酸铵,因铵离子是T,多核苷酸激酶的强烈抑制剂。当用较高浓度的乙醇沉淀RNA时,常用LiCl,因LiCl在乙醇中溶解度很高,不随核酸共沉淀。含有SDS的核酸样品,应使用NaCl,这时该去垢剂要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀,大多使用醋酸钠(pH5.2 )。

  将抽提好的核酸直接用于后续的实验,是唯一可靠的检测方法;除此之外的检测方法,都是相对的,而且并不十分可信。目前用于正式实验前检测核酸质量的方法,一是电泳,二是紫外分光光度仪。电泳检测的主要是核酸的完整性和大小,只要核酸不是太小或者太大 (超出电泳分离范围),该方法还是非常可信的;电泳还可以用于估计核酸的浓度,但其准确度与经验有关;另外,电泳也可能提供某些杂质污染的信息,但是同样与经验有关。紫外分光光度仪检测的是纯度和核酸含量,然而,由于紫外分光光度仪不能确保非常准确,而该仪器的灵敏度又非常高,所以,提供的结果并不十分可信。一般讲,同时进行紫外和电泳检测,综合二者的结果,可以做出一个更合理的判断。但由于这两个方法都有缺陷,所以,即使出现坏的结果能用于后续实验而好的结果却不能用于后续实验,也不用大惊小怪。 关于紫外分光光度仪的检测。首先,不要使用不能选择波长的仪器;使用那些已经固定了波长的仪器,大概可以算是你梦魇的开始 (没有信息是可怕的,更可怕的是将错误的信息当线nm下的吸光度分别代表了核酸、背景(溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白等有机物的值。)。其次,一定要经常调较仪器;最后,要记住读数A230 :A260 :A280 = 1:2 (DNA 为 1.8) :1 为理论上的数据,实际测定时会有一些差别;但如果差别太大,就有问题了,有两个值得商榷的观点:如果 A260/A230 2 就是纯的,如果 A260/A280 2 就是核酸降解。A260/A230 如果比2.0 大许多,一定是有杂质残留的 (具体是什么杂质我不知道)。如果核酸抽提好后立即就测定,A260/A280 2.0 决不提示核酸降解,原因是:那些能导致 A260/A280 2.0 的核酸片段非常小,常规的沉淀是不可能将它们沉淀下来的;更可能的原因是:你仪器提供的 A260/A280 实际是 A262/A282 甚至 A264/A284 的值。纯的核酸的吸光值,在 A230 是谷底,在 A260 是峰顶,在 A280 则正好是半山坡。根据曲线在底和顶的斜率最小,在半山坡的斜率最大的特点,不难得出如下结论:A230 和 A260 的读数受仪器准确性的影响比较小,而 A280 受仪器准确性的影响比较大。关于电泳检测,观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团,这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近,导致染料与DNA结合并呈现荧光,其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料,而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下,被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此,当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。

  建议先电泳检测,再用紫外分光光度仪检测。电泳后,可以看到哪些样品根本就不能用 (如降解太厉害),以及核酸的大致浓度,这样就为紫外分光光度仪的检测提供了一个参考 (降解的不必要测了,要测的该取多少量等)。

  对于一些对核酸纯度要求较高的实验,我们就需要对其进行特殊的处理,除去其中的多糖、蛋白质及非目的核酸,其方法如下:

  (1)肝糖元、淀粉及粘多糖,由于其物理化学性质与核酸有许多相似之处,常在提取液中残存下来。除去的方法常有:①取材前尽量减少组织中多糖的含量,如先使动物饥饿数天然后杀死,可使细胞内肝糖元大大减少。②加入淀粉酶,将大分子多糖分解为小分子,在以后纯化步骤中逐渐被除去。③在浓磷酸盐存在下,以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液,使多糖溶于下层水相,核酸在上面有机层中。④以钙盐沉淀DNA,再以草酸钾处理,使之形成DNA钾盐回收,然后用离子交换法吸附DNA,使之与多糖分离。

  (2)蛋白质的除去:由于核酸在细胞内以核蛋白体形式存在,不论采用哪种方法提取核酸,蛋白质都不同程度地存在于体系中。因此,除去蛋白质是核酸分离纯化不可避免的步骤。常用方法有下列几种:①加入去污剂如硫酸十二脂钠,从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用,效果更加理想。②氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提,蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶,离心后除去,核酸留在水溶液中。此法在分离纯化中也常反复使用。③苯酚水溶液抽提,在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下,极速11选5DNA或RNA都可以进入水相,蛋白质则沉淀于酚层,然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA,残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。

  (3)不同类型核酸的分离:两种类型核酸的制备过程中,DNA制品中混杂着少量RNA或RNA制品中混杂着少量DNA是经常发生的。由于DNA和RNA结构和性质都很相似,而且分子量都十分大,所以两类核酸的分离是核酸纯化工作中比较复杂和繁琐的一步。从DNA中除去RNA的方法常有:①核糖核酸酸酶选择地破坏RNA,这是比较有效的方法,但使用的核糖核酸酶中常含有极微量的脱氧核糖核酸酶,必须事先加热处理除去,然后将纯净的核糖核酸酶与样品溶液一起在37℃孵育数分钟,就可达到破坏RNA的目的。②钙盐分步沉淀:在核酸溶液中加入1/10体积10%的氯化钙溶液,使DNA与RNA均成为钙盐后,再利用DNA钙盐在2/10体积乙醇中能形成沉淀析出,RNA钙盐不形成沉淀而彼此分离。③活性炭吸附:将处理好的活性炭按1/15~1/20体积加入每毫升含有0。5~1mgDNA溶液中,0~4。C下搅拌1h ,以31000×g离心1h,除去RNA后的DNA回收率可达94%。 在RNA制品中除去DNA,苯酚水溶液抽提是较有效和常用的方法。在没有阴离子化合物存在下,以等体积90%苯酚水溶液反复抽提RNA,可以除去绝大部分DNA。此外,也可采用加入脱氧核糖核酸酶处理,破坏DNA,或参考上述DNA与RNA分离方法将DNA除去。

  (4)同类核酸的分离:①RNA混合物的分离:经过提取的初步纯化的RNA制品中含有各类RNA和某些已降解的RNA混杂物。进一步纯化时,多应用柱层析、梯度离心及逆流分溶等方法。例如tRNA与rRNA的分离用吸附于硅藻土表面的甲基化白蛋白柱吸附后,以不同梯度氯化钠溶液洗脱,或用蔗糖梯度(顶部5%浓度,底部20%浓度)离心法分开。mRNA的代谢速度较快,在细菌中平均寿命为90min,在哺乳动物中约为几小时至十几小时,常用密度梯度离心法和DNA-琼脂柱进行分离。制备rRNA时,由于共沉作用,常混有mRNA,一般可用萘-1,5-二磺酸处理,使二者分开。各种tRNA的提纯,通常采用逆流分溶法在磷酸缓冲液-甲酰胺-异丙醇系统下进行,分离效果较好。②DNA混合物的分离:主要是变性或降解的DNA和天然的分离,常用磷酸钙、ECTEOLA-纤维素、DEAE-纤维素和甲基化白蛋白柱层析,逆流分溶,梯度离心等方法。一个具有生物活性高度提纯的DNA制品应具有如下标准:不含有蛋白质及多糖;不含有可透析的小分子杂物;在pH7时紫外吸收最大值在257~261μm之间,E(P)在6600左右;不含有RNA;固体为纤维状,水溶液具有高的粘度并有流动双折射作用;具有电泳均一性及超离心中单分散性;具有生物活性。

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